Die ständige Zunahme von Wissen und Erkenntnis innerhalb der Physik erforderte eine Differenzierung, auch im Bereich der Lehre und somit die Schaffung neuer Professuren.

Die mathematische Physik, die bisher auch von Hagenbach-Bischoff unterrichtet wurde, übernahm 1889 als selbstständiges Spezialfach Karl von der Mühll. Die sich immer mehr erweiternden Naturwissenschaften sahen ihre Bedürfnisse in den Räumlichkeiten des Neuen Museums immer weniger erfüllt. Um der Platznot Abhilfe zu schaffen, wurde 1872 schliesslich das Bernoullianum unter grossem Engagement von Hagenbach-Bischoff gebaut. Seinen Bemühungen ist es zu verdanken, dass 90% der Baukosten durch Spenden gedeckt werden konnten. Physik und Chemie zogen nach der Einweihung 1874 in das Gebäude, das der Familie Bernoulli gewidmet ist und sich in der Nähe des Petersplatzes befindet. Die Namensgebung des Gebäudes zeigt die Bedeutung der Bernoullis und die andauernde Erinnerung an sie in Basel auf besonders deutliche Weise. Der grosse Hörsaal des Bernoullianums fasste 450 Personen und bot Platz für öffentliche Vorträge, die von 1874 an regelmässig hier abgehalten wurden.

Nach dem Tod Eduard Hagenbach-Bischoffs ging der Lehrstuhl für Physik 1910 auf seinen Sohn August Hagenbach über. August Hagenbach wandte sich dem aufstrebenden Gebiet der Spektroskopie zu, insbesondere der Molekülspektroskopie und der Untersuchung der verschiedenen Entladungsformen im Licht- und Glimmbogen. Die Beobachtungsmethoden der Spektroskopie untersuchen das von einer Probe abgestrahlte oder gestreute Licht, um Eigenschaften des Probenmaterials zu erforschen. Hagenbach trug durch die Entwicklung neuer experimenteller Methoden entscheidend zur Förderung dieses jungen Gebiets bei, das in den folgenden Jahren den Schwerpunkt der Basler Physik konstituierte. Neben Hagenbach arbeitete auf diesem Gebiet Max Wehrli, der 1934 zum ausserordentlichen Professor ernannt wurde und 1942 die Leitung der neu geschaffenen Abteilung für Spektralphysik übernahm.

Hagenbachs berühmtester Student war der 1905 in Basel geborene Ernst C.G. Stueckelberg (mit vollem Namen Johann Melchior Ernst Karl Gerlach Stueckelberg-von Breidenbach). Er studierte seit 1923 Physik an der Universität Basel und verbrachte 1924/25 zwei Auslandssemester in München, wo er u.a. bei A. Sommerfeld Vorlesungen hörte und W. Heisenberg kennenlernte. Danach setzte er sein Studium in Basel fort und promovierte 1927 bei A. Hagenbach über ein spektroskopisches Thema. Nach einigen Jahren als Postdoc und Assistenzprofessor in Princeton kehrte er nach Basel zurück. In dieser Zeit veröffentlichte er unter anderem die berühmte Arbeit zur heute sogenannten «Landau-Zener-Stueckelberg-Theorie» nichtadiabatischer Übergänge. 1933 wurde er Privatdozent an der Universität Zürich, und 1935 Professor an der Universität Genf. In den darauffolgenden Jahren veröffentlichte er geniale Arbeiten zu Kernkräften, zur Streuung von Elementarteilchen, und zur sogenannten Renormierungsgruppe. Für alle diese Themen wurden später Nobelpreise verliehen (an Yukawa, Feynman und Wilson): Stueckelbergs Arbeiten waren ihrer Zeit zu weit voraus. 1976 erhielt er die Max-Planck Medaille (die höchste von der Deutschen Physikalischen Gesellschaft verliehene Auszeichunung in der Theoretischen Physik) für sein Lebenswerk.  

Die schnelle Entwicklung der Physik im ersten Viertel des 20. Jahrhunderts äusserte sich auch in steigenden Studentenzahlen. In den Vorlesungen über Experimentalphysik mussten sich nun über hundert Hörer mit 60 vorgesehenen Plätzen im Auditorium begnügen. Auch war zu wenig Platz für die Versuche im Fortgeschrittenen-Praktikum. Die Physik hatte sich so vergrössert, dass das Bernoullianum den Anforderungen nicht mehr genügte. Als schliesslich Pläne für den Bau der Strassenbahn in unmittelbarer Nähe des Instituts aufkamen, wurde der Bau eines neues Gebäudes immer dringlicher. Man entschied sich für einen Standort in der Klingelbergstrasse und zog nach vier Jahren Bauzeit 1926 in die neue «Physikalische Anstalt». 

Vom Bernoullianum zur Mustermesse. Frühe Radiotechnik in Basel
1923 wurde von Basel aus die erste Schweizer Radiosendung gesendet. Dies ist dem Engangement von Hans Zickendraht zu verdanken. Zickendraht, der 1915 zum a.o. Professor für Angewandte Physik ernannt wurde, sah sich als Bindeglied zwischen der wissenschaftlichen Grundlagenforschung und der technischen Anwendung neuer Erkenntnisse. Im Jahre 1913 hielt Zickendraht zum ersten Mal Vorlesungen über die drahtlose Telegraphie. Damit knüpfte er an das Interesse von Hagenbach-Bischoff an der Telegraphie an, die zunächst noch einen Draht benötigte. 1915 wurden vom Bernoullianum aus dann die ersten funktelegraphischen Versuche durchgeführt, 1923 strahlte ein im Bernoullianum installierter 20W-Sender die ersten Rundfunksendungen aus. Die Sendungen wurden hauptsächlich von der Mustermesse empfangen, um den Besuchern das neue Medium nahe zu bringen. Der Sender im Bernoullianum markierte die Anfänge des späteren Senders Radio Beromünster. Zickendraht war es auch, der die Feierlichkeiten zur Eröffnung des neuen Kollegiengebäudes im Jahre 1939 und weitere Anlässe auf Film festhielt.

Etbalierung der theoretischen Physik und der Kernphysik
Die Ausdifferenzierung innerhalb der Physik setzte sich in den 1930er Jahren fort. In der Physik wurde zusätzlich zur Professur für Experimentalphysik eine neue ordentliche Professur für Theoretische Physik geschaffen. Mit diesem Lehrstuhl wurde 1944 der Basler Markus Fierz betraut. Er verfasste bedeutende Arbeiten zur Quantenfeldtheorie, die eine Erweiterung der Quantenmechanik darstellt. 1959 wurde Fierz Leiter der Theorieabteilung am 1954 gegründeten Conseil Européen pour la Recherche Nucléaire (CERN) in Genf, einem der weltweit bedeutendsten Forschungszentren der Teilchenphysik. Ein Jahr später folgte er seinem verstorbenen Lehrer Wolfgang Pauli als Professor an die ETH Zürich. Nach dem Tod von Max Wehrli wurde die Abteilung für optische Spektroskopie unter Ernst Miescher weitergeführt. Mit der Ausmessung und Deutung von hochaufgelösten Spektren des Stickoxyds NO trug seine Gruppe ganz wesentlich zum tieferen Verständnis von zweiatomigen Molekülen bei, welche beispielsweise bei photophysikalischen Prozessen in der Erdatmosphäre eine wichtige Rolle spielen.

Die Nachfolge von August Hagenbach als Professor für Experimentalphysik und als Vorsteher der Physikalischen Anstalt trat 1942 Paul Huber an. Mit seiner Berufung verlagerte sich der Schwerpunkt der Forschung von der Spektroskopie zur damals aufstrebenden Kernphysik. Zur Erforschung des Atomkerns waren neuartige Apparate und Instrumente nötig, die noch nicht serienmässig hergestellt wurden. Bei ihrer Entwicklung in Zusammenarbeit mit der Industrie wurde oft technisches Neuland betreten. 1942 begannen Physiker zusammen mit der Firma Haefely & Co., Basel, den Bau eines ersten kleinen Teilchen-Beschleunigers, mit dem Energien von 200 keV erzielt werden konnten. Im Laufe der folgenden Jahre wurden weitere, leistungsfähigere Beschleunigungsanlagen gebaut. Eine wichtige apparative Neuerung konnte 1960 mit der Quelle polarisierter Deuteronen in Betrieb genommen werden. Eine solche Quelle war damals für das Studium der Kernwechselwirkungen von grösstem Interesse. Damit konnten entscheidende Experimente zur Abklärung der Kernstruktur und von Kernreaktionsmechanismen durchgeführt werden. Diese Entwicklungen unter Paul Huber waren nur dank einer Reihe sehr engagierter, jüngerer Mitarbeiter möglich. Neben Eugen Baumgartner sind hier vor allem Hermann Rudin, Hans-Rudolf Striebel und Rolf Wagner zu erwähnen, die sich später alle als Professoren viele Jahre lang auch für die Lehre in der Experimentalphysik sehr eingesetzt haben.